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Riferimento: Gómez-Molina, E.; Marco, P.; Garcia-Barreda, S.; González, V.; Sánchez, S. Effect of Selected Truffle-Associated Bacteria and Fungi on the Mycorrhization of Quercus ilex Seedlings with Tuber melanosporum. BioTech 2025, 14, 69. https://doi.org/10.3390/biotech14030069
La simbiosi micorrizica è ormai riconosciuta come qualcosa di molto più di una semplice relazione bilaterale tra funghi e radici delle piante. I batteri e i funghi del suolo svolgono un ruolo essenziale nei complessi processi biologici di scambio di nutrienti e di segnalazione tra i funghi del suolo e le radici delle piante. Si ritiene che molti microrganismi identificati nelle micorrize dei tartufi, negli ascocarpi dei tartufi o nel suolo abbiano alcune attività che favoriscono la crescita delle piante (PGP – Plant Growth-Promoting) o di aiuto alla micorrizzazione (MH – Mycorrhizal Helper). Batteri quali Bradyrhizobium, Pseudomonas, Rhizobium, Variovorax ed Ensifer dominano spesso la comunità batterica degli ascocarpi dei tartufi e sono noti per il loro ruolo attivo nella micorrizzazione e nello sviluppo della pianta ospite.
Cresce l’interesse per l’uso di batteri specifici per migliorare la colonizzazione micorrizica delle piantine inoculate con tartufo in vivaio. Diversi studi hanno già valutato l’effetto di batteri selezionati sulla colonizzazione radicale da parte di T. melanosporum in diverse specie ospiti come Corylus avellana, Pinus halepensis, Pinus nigra, Quercus faginea e Quercus ilex. Tuttavia, questi studi hanno riportato effetti contrastanti sui livelli di micorrizzazione da parte del tartufo e hanno utilizzato principalmente ceppi commerciali, piuttosto che ceppi isolati direttamente dalla micorrizosfera o dagli ascocarpi di T. melanosporum, ad eccezione di Mamoun e Olivier (1992 Plant and Soil). Inoltre, le informazioni su Quercus ilex, sebbene sia l’ospite principale di T. melanosporum in Spagna e ampiamente utilizzato in Francia e in Italia, rimane limitato.
In questo contesto, Eva Gomez-Molina e collaboratori, in uno studio pubblicato nel 2025 sulla rivista BioTech, hanno valutato la capacità di dodici ceppi batterici e fungini endofiti, isolati dall’ambiente di T. melanosporum (gleba, micorrize e bruciato), di migliorare l’insediamento e la formazione di micorrize di tartufo nero sulle radici di piantine di Q. ilex in vivaio. Lo studio ha anche esaminato il loro effetto sulla crescita delle piantine. I ricercatori hanno ipotizzato che (i) le specie microbiche che vivono in associazione con i tartufi potrebbero svolgere un ruolo positivo nella formazione delle micorrize di T. melanosporum, et (ii) la co-inoculation de la truffe avec ces microorganismes pourrait influencer positivement la croissance des plants de Q. ilex. Lo stato micorrizico e la qualità vegetativa delle piantine sono infatti fattori rilevanti per la qualità complessiva delle piantine inoculate con T. melanosporum.
L’esperimento ha riguardato tredici ceppi microbici, dodici dei quali sono stati isolati dall’ambiente del tartufo nero e uno, Bradyrhizobium japonicum. (BJ, numero di accesso DSM: 30131), è stata acquistata dalla Spanish Type Culture Collection. Tra questi ceppi, undici erano batterici e due fungini ( Tulasnella tubericola – TT e Trichoderma harzianum – TH). I dieci ceppi isolati dalla gleba del tartufo provenivano da ascocarpi raccolti in una piantagione nella Spagna orientale. Il ceppo TT è stato isolato da una micorriza di T. melanosporum, e il ceppo TH è stato isolato dal terreno all’interno di un’area bruciata da T. melanosporum.. Dopo l’identificazione mediante metodi basati sul sequenziamento, i ceppi sono stati preparati sotto forma di inoculo, coltivati in ambiente liquido e poi incapsulati in sfere di alginato prima dell’inoculazione.
Gli ascocarpi maturi di T. melanosporum utilizzati come inoculo sono stati raccolti nei tartufaie della provincia di Huesca (Spagna), puliti, sterilizzati in superficie, quindi disidratati e ridotti in polvere fine. Le ghiande di Q. ilex, provenienti dalla regione spagnola del Sistema Ibérico, sono stati sterilizzati in superficie e germinati. Nel giugno 2018, le piantine che avevano sviluppato da 6 a 8 foglie e radici laterali sono state trapiantate in vasi e contemporaneamente inoculate con i ceppi microbici selezionati e T. melanosporum. L’inoculazione microbica è stata effettuata mescolando 2,5 mL di sfere di alginato per vaso nel substrato di rinvaso (torba bianca e torba nera con pH regolato a 7,5). L’inoculazione del tartufo è stata effettuata mediante spolveratura delle radici con un supporto di talco, nella misura di 1,5 g di tartufo fresco per pianta. Sono state preparate dodici ripetizioni per trattamento e sono stati inclusi due trattamenti di controllo: un controllo procedurale (P-Con) con sfere di alginato senza contenuto microbico e un controllo assoluto (A-Con) senza aggiunta di sfere. Sono state coltivate anche piante supplementari senza inoculo di tartufo per garantire che le micorrize del tartufo provenissero esclusivamente dall’inoculo somministrato.
Le piantine sono state mantenute in serra per dieci mesi. Nell’aprile 2019 sono stati misurati la lunghezza dello stelo e il diametro del colletto delle piantine. Dopo un’accurata pulizia, gli apparati radicali sono stati analizzati per valutare la colonizzazione da parte dei funghi ectomicorrizici, utilizzando il metodo INIA-Aragón. Le radici sono state divise in tre segmenti di profondità e almeno 100 estremità radicali per segmento sono state contate e classificate come non micorrizate, micorrizate da T. melanosporum o da morfotipi contaminanti, l’unico contaminante riscontrato è stato Sphaerosporella brunnea.. Quattro piante sono state escluse a causa della scarsa crescita, portando la dimensione finale del campione a 176.
Sono state effettuate analisi statistiche per testare gli effetti dei microrganismi sulla micorrizzazione, sulla crescita delle piantine e sulla distribuzione della colonizzazione nel sistema radicale.
Dieci mesi dopo l’inoculazione, i risultati hanno rivelato una micorrizzazione media delle radici da parte del T. melanosporum. del 22,8% (deviazione standard: 11,5). Tutte le piantine presentavano micorrize di T. melanosporum, ad eccezione di alcuni in alcuni trattamenti (due nel trattamento con T. harzianum, uno nel trattamento con B. japonicum e tre nel trattamento con Ensifer adhaerens – EA2). L’analisi statistica ha dimostrato che almeno uno dei microrganismi co-inoculati aveva un effetto significativo sulla colonizzazione radicale da parte di T. melanosporum nelle piantine di Q. ilex (F = 6553, p-value = 0,003, n = 176).
L’analisi post hoc ha indicato che il trattamento AT2 (Agrobacterium tumefaciens ceppo 2) era l’unico a presentare livelli di micorrizzazione significativamente più elevati rispetto al controllo procedurale (P-Con). Questa è una scoperta fondamentale dello studio, che sottolinea il potenziale ruolo di questo ceppo come batterio ausiliario della micorrizzazione. Il ceppo AT1, un altro ceppo di Agrobacterium tumefaciens, ha anche mostrato un effetto positivo marginalmente significativo sulla micorrizzazione (p = 0,055). Inoltre, i ceppi Variovorax sp. (Vsp) e il ceppo commerciale Bradyrhizobium japonicum (BJ) hanno mostrato effetti positivi marginalmente significativi sulla micorrizzazione da parte di T. melanosporum (p = 0,069 e p = 0,068, rispettivamente).
Al contrario, il trattamento con il ceppo TH (Trichoderma harzianum) ha mostrato valori significativamente inferiori di micorrizzazione rispetto alla maggior parte degli altri trattamenti di co-inoculazione. Questo effetto inibitorio è in contraddizione con uno studio precedente che aveva riportato un miglioramento significativo della micorrizzazione dei tartufi da parte di T. harzianum.
I ceppi rimanenti non hanno mostrato effetti significativi sulla micorrizzazione delle piantine. Ciò include due ceppi autoctoni di Pseudomonas (Psp1 e Psp2), nonché i due ceppi di Ensifer adhaerens (EA1, EA2) e i due ceppi di Kocuria rhizophila (KR1, KR2).
L’unico fungo ectomicorrizico contaminante rilevato nei campioni era S. brunnea.. Questo fungo è comparso nel 3,4% delle piantine inoculate con il tartufo, con un valore medio di colonizzazione radicale dello 0,2%. L’analisi statistica ha dimostrato che la frequenza di comparsa di S. brunnea non era significativamente influenzata dai microrganismi co-inoculati (z-value = 0,002, p = 0,99, n = 176). Anche le piantine supplementari non inoculate dal tartufo presentavano micorrize di S. brunnea, ma nessuna micorriza di T. melanosporum o altri funghi ectomicorrizici. Queste osservazioni confermano che le differenze di colonizzazione da parte di T. melanosporum possono essere attribuite ai trattamenti applicati.
Le piantine inoculate con T. melanosporum presentavano una lunghezza media dello stelo di 11,7 cm (deviazione standard: 3,1) e un diametro medio del colletto di 4,3 mm (deviazione standard: 0,8). La lunghezza dello stelo non è stata influenzata in modo significativo dai microrganismi co-inoculati (F = 1,72, p = 0,056, n = 176). Il diametro del colletto ha mostrato differenze significative tra alcuni dei microrganismi co-inoculati (F = 3,07, p < 0,001, n = 176), ma nessuno dei trattamenti di co-inoculazione ha mostrato differenze significative rispetto ai trattamenti di controllo. Ciò significa che i microrganismi testati non hanno avuto un impatto significativo sulla crescita vegetativa delle piante di Q. ilex nelle condizioni dello studio.
L’analisi statistica non ha rivelato alcuna interazione significativa tra i microrganismi co-inoculati e i segmenti di profondità delle radici (F = 1,16, p = 0,27, n = 528). Tuttavia, la percentuale di colonizzazione radicale da parte di T. melanosporum era significativamente influenzato dal segmento di profondità (F = 214,84, p< 0,001, n = 528), con una colonizzazione decrescente con la profondità per tutti i trattamenti di co-inoculazione. Ciò suggerisce che i microrganismi non hanno alterato la distribuzione verticale delle micorrize del tartufo, che tendono naturalmente ad essere più abbondanti negli strati superiori del suolo.
I risultati di questo studio forniscono importanti contributi alla comprensione delle interazioni microbiche nella micorizosfera del tartufo e al miglioramento della produzione di piantine di tartufo nei vivai.
La scoperta più significativa è che la co-inoculazione di T. melanosporum con il ceppo AT2 (Agrobacterium tumefaciens) ha determinato livelli di colonizzazione significativamente più elevati rispetto al controllo. Anche il ceppo AT1 ha mostrato un effetto positivo marginalmente significativo. Agrobacterium tumefaciens è un batterio del suolo molto diffuso, generalmente associato alle radici, ai tuberi o agli steli sotterranei. Sebbene studi recenti abbiano riclassificato la maggior parte delle specie del genere Agrobacterium sotto il genere Rhizobium, questo ceppo AT2 ha dimostrato capacità di aiuto alla micorrizzazione (MH). I Rhizobium e altri membri della famiglia Rhizobiaceae sono noti per le loro proprietà di promozione della crescita delle piante (PGP) e per il loro ruolo di batteri ausiliari della micorrizzazione. Sebbene l’analisi del DNA non abbia permesso di classificare con precisione il ceppo AT2 a causa della sua somiglianza con diversi ceppi di Agrobacterium e Rhizobium, la ricostruzione filogenetica ha confermato la sua classificazione come A. tumefaciens.. È possibile che questo ceppo appartenga a uno dei complessi A. tumefaciens, che comprende microrganismi sia patogeni che non patogeni (del tipo Rhizobium radiobacter). Le capacità MH del ceppo AT2, simili a quelle riscontrate in altri ceppi Rhizobium come Rhizobium pusense, lo rendono un candidato promettente per migliorare la qualità delle piantine micorrizate dal tartufo nero in vivaio. I meccanismi precisi attraverso i quali il ceppo AT2 contribuisce a questo processo rimangono da chiarire, ma i batteri MH possono agire in vari modi: mobilizzando i nutrienti del suolo, fissando l’azoto atmosferico, producendo fattori di crescita e proteggendo il sistema radicale-fungo dagli agenti patogeni. Queste attività possono indurre la germinazione delle spore, migliorare la crescita delle ife, promuovere la ramificazione delle radici e i contatti radice-fungo e attenuare lo stress chimico o biologico.
Contrariamente ad alcune aspettative basate su studi precedenti, lo studio non ha dimostrato alcun effetto significativo dei due ceppi nativi di Pseudomonas sui livelli di micorrizzazione da parte di T. melanosporum.. Le ricerche precedenti sull’effetto di Pseudomonas sulla micorrizzazione da parte del tartufo hanno riportato effetti contrastanti, che vanno da effetti negativi temporanei a effetti positivi per alcuni ceppi su Pinus halepensis, ma non significativi su Pinus nigra e Quercus faginea.. I risultati non significativi di questo studio per i ceppi autoctoni di Pseudomonas, così come i risultati contraddittori di altre ricerche, suggeriscono un interesse limitato di questo tipo per il miglioramento diretto dei livelli di micorizzazione delle piantine di tartufo in vivaio. Tuttavia, è importante notare che studi precedenti hanno dimostrato che l’inoculazione con alcuni ceppi di Pseudomonas fluorescens potrebbe migliorare la crescita e la tolleranza alla siccità in altre specie arboree. Una valutazione delle capacità di promozione della crescita delle piante (PGP) dei microrganismi associati al tartufo potrebbe quindi essere rilevante in futuro, soprattutto in condizioni di stress quali la limitazione dei nutrienti.
Lo studio ha dimostrato effetti positivi marginalmente significativi dei ceppi Variovorax sp. (Vsp) e del ceppo commerciale Bradyrhizobium japonicum (BJ) sulla micorrizzazione da parte di T. melanosporum.. Questi generi sono tra quelli più frequentemente rilevati negli ascocarpi e nelle micorrize dei tartufi. Tuttavia, un altro studio ha rilevato che la co-inoculazione di un ceppo di Bradyrhizobium con T. melanosporum non migliorava significativamente la micorrizzazione e riduceva la densità delle radici fini. Questa divergenza sottolinea la necessità di valutare ulteriormente altri ceppi autoctoni di questi generi per confermare le loro capacità MH.
Il ceppo TH (Trichoderma harzianum) ha mostrato una colonizzazione da parte di T. melanosporum. significativamente più basso rispetto alla maggior parte degli altri trattamenti microbici. Questo effetto inibitorio è in linea con il ruolo riconosciuto di T. harzianum come agente di biocontrollo, caratterizzato dalla sua attività fungicida. Questo fungo è noto per la produzione di chitinasi extracellulari, antibiotici (come la gliotossina) e altri metaboliti secondari, nonché per il suo comportamento iperparassitario e la sua capacità di colonizzare in modo massiccio la rizosfera e altri organi vegetali. Alcuni ricercatori hanno inoltre messo in discussione l’uso di Trichoderma spp. come agenti di biocontrollo nei vivai forestali grazie al loro antagonismo nei confronti della colonizzazione ectomicorrizica. Questi risultati sono anche coerenti con esperimenti precedenti in cui diversi ceppi di I T. harzianum originari dei terreni tartufiggi hanno mostrato effetti inibitori in vitro sulla crescita miceliale di Armillaria mellea e S. brunnea.
Nel complesso, i risultati di questo studio non dimostrano che i batteri e i funghi associati al T. melanosporum possiedono sistematicamente capacità di aiuto alla micorrizzazione (MH). Gli effetti non significativi osservati per numerosi taxa potrebbero indicare che essi non svolgono un ruolo preponderante nella formazione delle micorrize o nella promozione della crescita delle piante nelle condizioni dello studio. È anche possibile che siano coinvolti in processi metabolici o fisiologici specifici che non si riflettono direttamente nei tassi di micorrizzazione o nelle dimensioni delle piantine, oppure che sia necessaria l’azione combinata di più taxa per ottenere un impatto efficace, come suggerito da altri studi.
Lo studio è stato condotto in condizioni standard di vivaio, riconoscendo che la presenza incontrollata di popolazioni microbiche nel substrato e nell’ambiente della serra potrebbe influenzare i risultati. Tuttavia, l’obiettivo era quello di riflettere le pratiche correnti nei vivai, dove la qualità delle piantine di tartufo dipende dalla percentuale di radici colonizzate da funghi ectomicorrizici. I trattamenti, compresi i controlli, sono stati applicati a piantine provenienti dallo stesso lotto, utilizzando lo stesso substrato e coltivate in condizioni omogenee. Inoltre, non sono state riscontrate differenze significative nei tassi di colonizzazione da parte di S. brunnea non è stata rilevata tra i trattamenti, il che rafforza la conclusione che le differenze osservate nella colonizzazione da parte di T. melanosporum sono attribuibili ai trattamenti microbici specifici.
In conclusione, questo studio è riuscito a identificare un ceppo di Agrobacterium tumefaciens (AT2), isolato dal terreno di T. melanosporum, che ha migliorato significativamente la micorrizzazione delle radici di Q. ilex da parte di T. melanosporum. in condizioni di vivaio. Questo risultato avvalora l’ipotesi secondo cui alcuni microrganismi naturalmente presenti nella micorizosfera dei tartufi possono agire come batteri ausiliari della micorizzazione. Al contrario, la colonizzazione da parte di T. melanosporum è risultato significativamente più debole in presenza del ceppo Trichoderma harzianum (TH), mentre altri ceppi rizobatterici (dei generi Pseudomonas, Ensifer o Variovorax) non hanno mostrato alcun effetto significativo né sulla micorrizzazione dei tartufi né sulla crescita delle piantine.
Nell’ambito delle attuali pratiche dei vivai, che implicano condizioni altamente controllate e asettiche che riducono la diversità dei microrganismi indigeni della micorizosfera, questi risultati evidenziano il potenziale dell’aggiunta controllata di ceppi microbici specifici con capacità di favorire la micorrizzazione per migliorare la qualità delle piantine inoculate e l’efficacia simbiotica nelle condizioni di produzione di routine nei vivai. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per acquisire una comprensione più approfondita delle interazioni all’interno della micorizosfera che potrebbero contribuire al miglioramento della qualità delle piantine in vivaio. Una migliore caratterizzazione dei meccanismi d’azione di questi batteri MH, in particolare attraverso il sequenziamento completo del genoma per confermare l’identità dei ceppi, e studi che valutino le loro capacità PGP, potrebbero aprire nuove strade per ottimizzare la coltivazione del tartufo nero.
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